中国农科院等建立双子叶植物高效Csy4-PE6d引导编辑系统，加速蔬菜育种性状的精准设计

       近日，中国农业科学院蔬菜花卉研究所杨学勇团队联合安徽农业大学魏鹏程团队等在JIPB发表题为 “Development of a highly efficient prime editing platform for cucurbits enables breeding of multi-disease resistant cucumber” 的研究论文。研究建立了高效引导编辑系统 Csy4-PE6d，显著提升了黄瓜、甜瓜、南瓜等作物的精准编辑效率，并进一步在黄瓜中定向创制出兼具细菌性角斑病和霜霉病抗性的种质材料，为双子叶作物基因功能研究和精准育种提供了新的技术平台。

研究背景

       引导编辑（Prime Editing，PE）能够在不产生DNA双链断裂的情况下实现精准碱基替换和小片段插入/缺失，是作物精准育种的重要技术。然而，PE在黄瓜、甜瓜 、南瓜等双子叶作物中长期面临遗传转化效率低、编辑活性不足以及可遗传纯合编辑材料获得困难等瓶颈。

研究内容

       1. 系统优化遗传转化与PE表达体系

       针对葫芦科作物遗传转化效率偏低的问题，研究团队首先优化了转化筛选体系。通过引入壮观霉素（spectinomycin）作为筛选剂，有效抑制非转化外植体生长，提高了黄瓜、甜瓜和南瓜的遗传转化效率（图1A, B）。

       在此基础上，团队进一步优化PE蛋白的表达。采用番茄来源的SlEF1α启动子替代常用CaMV35S启动子后，ePE2系统在黄瓜靶位点的编辑效率最高提高5.4倍（图1C），表明启动子优化能够显著增强PE系统在黄瓜中的活性。

图1 遗传转化筛选与启动子优化提升黄瓜编辑效率

       2. Csy4-PE6d实现高效、纯合精准编辑

       为进一步提高pegRNA的稳定性和加工效率，团队引入Csy4核酸内切酶，构建并比较了5种不同结构的PE系统（图2A）。通过对黄瓜内源基因CsYUC4、CsARF3和CsCCD1进行点突变和碱基插入测试，最终筛选出性能最优的Csy4-PE6d系统。

       在稳定遗传转化植株中，Csy4-PE6d的平均精准编辑效率达到80.83%，纯合编辑效率达到36.44%，显著高于传统PE系统中不足10%的纯合编辑效率（图2B, C, D）。较高的纯合编辑效率有利于目标等位基因在早期世代快速固定，为缩短精准育种周期提供了重要技术基础。

       3. 在多种双子叶作物中具有较好的适用性

       研究进一步检验了Csy4-PE6d的跨物种编辑能力。针对同源 Cals1 基因，该系统在甜瓜、南瓜和马铃薯中的精准编辑效率分别达到 70.00%、78.26%和18.75%（图2E）。

图2 Csy4-PE6d系统的构建及其在多种双子叶作物中的高效编辑

       结果表明，Csy4-PE6d不仅适用于黄瓜，在多种双子叶作物, 包括大豆中也具有较好的编辑活性，为其进一步应用于不同园艺和经济作物提供了基础。

       4. 精准创制黄瓜双病抗性种质

       细菌性角斑病（Angular Leaf Spot，ALS）和霜霉病（Downy Mildew，DM）是黄瓜及其他葫芦科作物的重要病害。研究团队利用Csy4-PE6d，对感病黄瓜栽培品种9930的CsSGR基因进行精准编辑，将A323位点定向突变为G，并获得了无T-DNA的纯合编辑材料（sgr）（图3A）。

       病原菌接种试验显示，感病对照9930表现出严重病害症状，而sgr编辑材料对细菌性角斑病和霜霉病均表现出显著增强的抗性，其抗病表型与天然抗病材料Gy14相近（图3B）。这一结果表明，Csy4-PE6d不仅能够实现高效精准编辑，还能够直接用于优异农艺性状的定向创制，展示了其在作物精准育种中的应用潜力。

图3 Csy4-PE6d定向创制黄瓜双病抗性种质

研究意义

       该研究通过遗传转化体系优化、PE蛋白表达增强以及Csy4介导的pegRNA加工优化，建立了高效的Csy4-PE6d引导编辑平台。该系统在黄瓜中实现了高效率、高比例纯合的精准编辑，并可应用于甜瓜、南瓜和马铃薯等多种双子叶作物。进一步利用该系统定向创制黄瓜双病抗性种质，验证了其在精准育种中的实际应用价值。该研究为葫芦科及其他双子叶作物的基因功能解析、优异等位基因创制和精准育种提供了新的高效技术工具。

       中国农业科学院蔬菜花卉研究所博士后王俊雅、博士生肖玲和安徽农业大学辛同旭教授为论文第一作者；中国农业科学院蔬菜花卉研究所杨学勇研究员和安徽省农业科学院李娟研究员为共同通讯作者。中国农业科学院蔬菜所凌健研究员在病原菌接种上提供了重要帮助，安徽农业大学魏鹏程教授为该研究提供了重要指导。该研究得到国家自然科学基金、中国农业科学院科技创新工程、蔬菜生物育种全国重点实验室开放课题和北京市乡村振兴农业科技项目等项目资助。

原文链接：https://www.jipb.net/EN/10.1111/jipb.70375